Иммобилизация ферментов ионообменными смолами

Методы иммобилизации

Энзимы имеют активные аминокислотные базовые группы, например: амино, тиол (Cys), карбоксильные кислоты, гидроксил (Tyr, Hyp), гуанидил, имидазол, индол, — поэтому, они могут быть связаны с носителями или их производными. При иммобилизации ферментов важно поддерживать активность энзимных позиций, то есть никогда не менять активные аминокислотные базовые группы.

1) Метод связывания с носителем
Метод связывания с носителем делится на три вида: ковалентное связывание, ионное связывание и физические адсорбционные/гидрофобные методы.
Метод ковалентного связывания применяется для того, чтобы связать носители и их производные с реакционными группами энзимов (амино, тиол (Cys), карбоксильные кислоты, гидроксил (Tyr, Hyp), гуанидил, имидазол, индол).
Метод ионного связывания подразумевает связь энзимов с ионообменными группами нерастворимых в воде носителей по средствам ионных связей. В качестве носителей применяются ионообменные смолы и полисахариды с ионообменными группами. Не смотря на то, что ионная связь недостаточно сильна, чтобы идеально удержать ферменты в некоторых реакциях, ионообменные смолы все же имеют некоторые преимущества:

• Быстрая иммобилизация;
• Значительная физическая устойчивость при длительном использовании;
• Возможность использования реакторов с наполнителями;
• Носители могут использоваться повторно.
  Физический адсорбционный метод: энзимы адсорбируются гидрофобными связями или Ван-дер-Ваальсовыми силами в носитель, не обладающий функциональными группами (синтетические смолы). Повторное использование таких носителей почти невозможно по причине плохой десорбции адсорбированных энзимов кислотами или щелочами.

2) Метод поперечных связей
Применяется для связывания энзимов с водорастворимыми реагентами, которые имеют более двух функциональных групп: ферменты иммобилизуются химическими связями, а затем связывается поперечно глутаральдегидом, гексаметилендиизоцианатом или другими агентами.

3) Метод инкапсулирования
Существует два типа: пространственная решетка, при котором ферменты заключаются в гелевую пространственную решетку; второй – микро-капсульный тип, при котором ферменты оборачиваются полупроницаемой полимерной пленкой.

Преимущества иммобилизованных ферментов:

1) Стабилизация энзимной активности;
i) предотвращаются нарушения стабилизации, вызванные условиями реакции;
ii) предотвращаются контакты с материалами дезактивации (фенилацетат дезактивирует пенициллин G ацилазу при производстве 6-Аминопенициллиновой кислоты);
2) Ферменты могут использоваться повторно;
3) Простое выделение ферментов из реакционной смеси;
4) Гибкость применяемых процессов;
5) Могут предотвращать загрязнения микроорганизмами в случае низкой чистоты ферментов.

Продукты для иммобилизации ферментов Sepabeads®

Ионообменные смолы для иммобилизации ферментов серии Sepabeads® EC представлены в таблице ниже:

Преимущества Sepabeads® EC:
1) Высокая емкость;
2) Акриловая полимерная матрица с различными вариантами функциональных групп, пористости, гранулометрии;
3) Высокая степень поперечных связей обеспечивает превосходную физическую стабильность;
4) Очень низкая степень набухания и сжатия в высококонцентрированных растворах и стандартных растворителях.

Механизмы иммобилизации ферментов с помощью Sepabeads® представлены на рисунках: Рис.X-5-2, Рис.X-5-3, Рис.X-5-4.
EC-EP: оксирановая группа с аминогруппой энзима, полученная нуклеофильным замещением;
EC-HA: альдегидная группа, полученная путем нуклеофильного присоединения аминогруппы с глутаралдегидом к аминогруппе с энзимом;
EC-HG: альдегидная группа, полученная ковалентным связыванием гидроксильной группы с аминогруппой энзима.

Актуальные области применения:

1. Производство 6-Аминопенициллиновой кислоты из пенициллина G иммобилизованной пенициллин G ацилазой. Рисунки Рис.X-5-5 и Табл.X-5-2 показывают реакцию. Жизнь иммобилизованных ферментов достигает 1000-1500 циклов; конечной точкой считается момент, когда время реакции сокращается вдвое от первоначального.

Загрузка энзимов	300 ед/гр.сух.смолы
Уровень иммобилизации	≥99%
Активность Пенициллина G (K) при 28 oC	≥160 ед/гр.сух.смолы
Явный уровень иммобилизации	≥54%

Табл. X-5-2 Иммобилизация Пенициллин G ацилазы с помощью EC-EP. Активность Пенициллин G ациллазы >15 Ед/мг-протеин

2) Производство 7-Аминоцефалоспориновой кислоты из Цефалоспорина С с помощью иммобилизованной оксидазы D-аминокислот и ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспориновой кислоты.

Жизнь иммобилизованных ферментов составляет 100 циклов в случае с оксидазой D-аминокислот и 200-300 циклов для ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспориновой кислоты.